• Tom Holland vai Peter Parker / Người Nhện[12]: Một thiếu niên và Avenger nhận được khả năng giống như nhện sau khi bị cắn bởi một con nhện phóng xạ. Bộ phim khám phá những hậu quả sau cảnh mid-credit Người Nhện: Xa nhà (2019), trong đó danh tính Người Nhện của Peter bị bại lộ. Tom Holland cho biết Peter cảm thấy thất bại, bất an và rất hào hứng khi khám phá khía cạnh đen tối của nhân vật. Việc điều chỉnh trở lại để khắc họa Peter, bao gồm nâng cao cao độ giọng nói của anh ấy và quay trở lại tư duy của một "thiếu niên ngây thơ, quyến rũ", là điều kỳ lạ đối với Holland sau khi đảm nhận những vai trưởng thành hơn như trong Cherry (2021).
  • Tobey Maguire vai Peter Parker / Người Nhện: Một phiên bản của Peter Parker ở vũ trụ khác, người sử dụng mạng hữu cơ thay vì súng phóng tơ như những người đồng cấp thay thế của mình. Maguire thể hiện lại vai diễn từ loạt phim Spider-Man của Sam Raimi. Những Người Nhện khác gọi anh ta là "Peter-Two", trong khi trang web chính thức của Marvel đặt tên anh ta là "Friendly Neighborhood Spider-Man".[13] Maguire muốn bộ phim chỉ tiết lộ những chi tiết tối thiểu về những gì đã xảy ra với nhân vật của anh ấy sau các sự kiện ở Spider-Man 3 (2007).
  • Andrew Garfield vai Peter Parker / Người Nhện: Một phiên bản của Peter Parker ở vũ trụ khác, người bị ám ảnh bởi thất bại trong việc cứu người bạn gái đã qua đời của mình, Gwen Stacy. Garfield thể hiện lại vai diễn từ loạt phim The Amazing Spider-Man của Marc Webb. Những Người Nhện khác gọi anh ta là "Peter-Three", trong khi trang web chính thức của Marvel đặt tên anh ta là "The Amazing Spider-Man".[13] Garfield chấp nhận vai trò của mình với tư cách là người anh em giữa của nhóm và quan tâm đến việc khám phá ý tưởng về một Peter Parker bị tra tấn sau các sự kiện của The Amazing Spider-Man 2, bao gồm cả cách các bài học từ những sự kiện đó có thể được truyền cho nhân vật của Tom Holland. Anh rất biết ơn vì có cơ hội "thắt chặt một số kết thúc lỏng lẻo" cho việc hóa thân thành Peter Parker, và mô tả việc làm việc với Holland và Maguire là cơ hội để có "những cuộc trò chuyện sâu hơn... về trải nghiệm của chúng tôi với nhân vật"[14]. Parker cuối cùng đã cứu MJ trong lúc cao trào theo cách tương tự như cách anh ta không cứu được Stacy trong The Amazing Spider-Man 2. McKenna và đồng biên kịch Erik Sommers đã ghi nhận đạo diễn Jon Watts vì đã nảy ra ý tưởng trong khi họ xem một cuộn phim hình dung trước giới thiệu những ý tưởng cho trận chiến đỉnh cao.
• Zendaya vai MJ: Bạn cùng lớp và là bạn gái của Peter Parker.[15] Tên đầy đủ của cô là Michelle Jones-Watson, đưa cô đến gần hơn với nhân vật Mary Jane-Watson trong truyện tranh.[16]
• Benedict Cumberbatch vai Dr. Stephen Strange:
  Một bác sĩ phẫu thuật thần kinh trở thành Bậc thầy về Ma thuật Thần bí sau một vụ tai nạn xe hơi thảm khốc và buộc ông phải kết thúc sự nghiệp. Strange giữ vai trò cố vấn cho Peter thay thế Tony Stark (Robert Downey Jr.) trong Người Nhện: Trở về nhà (2017) và Nick Fury (Samuel L. Jackson) trong Người Nhện: Xa nhà (2019).[17]
• Jacob Batalon vai Ned Leeds: Bạn thân của Peter Parker.[18] Batalon đã giảm 46 kg cho vai diễn trong phim.[19]
• Jon Favreau vai Harold "Happy" Hogan: Cựu giám đốc lực lượng an ninh của tập đoàn Stark Industries, tài xế và vệ sĩ của Tony Stark, đồng thời là người trông nom Peter Parker.
• Jamie Foxx vai Maxwell "Max" Dillon / Electro:
  Một kỹ sư điện từ thực tại khác làm việc cho Oscorp Industries rồi không may biến thành một sinh vật hấp thụ và điều khiển điện năng sau một vụ tai nạn. Foxx quay trở lại với vai diễn của mình trong The Amazing Spider-Man 2 (2014) của Sony. Không giống như bộ phim trước, anh sẽ không còn được khắc hoạ với thân hình màu xanh, mà thay vào đó là màu vàng như trong truyện tranh.[18]
• Willem Dafoe vai Norman Osborn / Green Goblin: Một nhà khoa học và CEO của Oscorp từ một thực tại khác, người thử nghiệm một chất tăng cường sức mạnh không ổn định trên bản thân và phát triển một nhân cách điên rồ thay thế trong khi sử dụng áo giáp và thiết bị Oscorp tiên tiến. Dafoe thể hiện vai diễn của mình trong bộ ba phim Spider-Man của Sam Raimi. Công nghệ khử tuổi kỹ thuật số để đưa Dafoe giống với phiên bản 2002 của phim.
• Alfred Molina vai Otto Octavius / Tiến sỹ Bạch Tuộc: Một nhà khoa học từ thực tại khác với bốn xúc tu thông minh nhân tạo bị hợp nhất với cơ thể sau một vụ tai nạn thí nghiệm. Molina quay trở lại đảm nhận vai diễn của mình trong Spider-Man 2 (2004) của Sony.[20] CGI được sử dụng để bù đắp cho việc ông đã cao tuổi kể từ khi làm bộ phim đó. Các xúc tu cơ học được tạo ra cũng nhờ CGI thay vì thông qua điều khiển rối như trong Spider-Man 2 (2004). Công nghệ khử tuổi kỹ thuật số để đưa Molina giống với phiên bản 2004 của phim.
• Tony Revolori vai Eugene "Flash" Thompson: bạn cùng lớp với Peter và từng là người đối đầu với Peter[21]
• Marisa Tomei vai May Parker: Dì của Peter Parker[22]

Rhys Ifans trở lại đóng vai Curt Connors / Thằn Lằn, một nhà khoa học Oscorp từ một thực tại khác, người đã cố gắng tạo ra một loại huyết thanh tái tạo để giúp mọc lại các chi và mô người, nhưng bị biến thành một con quái vật bò sát lớn. Ifans đảm nhận vai diễn của mình trong The Amazing Spider-Man (2012) của Marc Webb. Thomas Haden Church trở lại đóng vai vai Flint Marko / Người Cát, một tên tội phạm đến từ một thực tại khác, người đã nhận được khả năng giống như cát sau một vụ tai nạn. Church đảm nhận vai trò của mình từ Spider-Man 3 (2007). Cả Ifans và Church đều quay lại lồng tiếng cho các nhân vật, mặc dù cảnh quay ở cuối phim khi họ trở lại hình dạng con người là cảnh quay lưu trữ từ The Amazing Spider-Man và Spider-Man 3, tương ứng. Watts đóng vai trò là người dự phòng cho Church trên phim trường bằng cách cung cấp tài liệu tham khảo ghi lại chuyển động cho bộ đôi cơ thể chưa được công nhận, người đã thay thế Church trong vai trò này. Charlie Cox trở lại vai diễn Matt Murdock, một luật sư mù ở New York, đồng thời là một anh hùng hoạt động với danh xưng Daredevil. Tom Hardy xuất hiện nhưng không được báo trước, trong cảnh mid-credit, Eddie Brock đã xuất hiện vai diễn của anh trong Vũ trụ Người Nhện của Sony - Venom.

Đảm nhận vai trò của họ từ các bộ phim Người Nhện MCU trước đó là Angourie Rice trong vai Betty Brant, bạn cùng lớp của Parker và bạn gái cũ của Leeds; Hannibal Buress trong vai Huấn luyện viên Wilson, giáo viên thể dục của Trường Khoa học và Công nghệ Midtown; Martin Starr trong vai Roger Harrington, giáo viên môn phối hợp học thuật của Parker; J.B. Smoove trong vai Julius Dell, giáo viên của Parker; và J. K. Simmons trong vai J. Jonah Jameson, người dẫn chương trình TheDailyBugle.net. Jake Gyllenhaal xuất hiện trong vai Quentin Beck / Mysterio qua cảnh quay lưu trữ từ Far From Home. ​​Cũng xuất hiện trong phim còn có Paula Newsome trong vai quản trị viên MIT, Arian Moayed trong vai Đặc vụ kiểm soát thiệt hại Cleary, Mary Rivera trong vai bà của Ned, và Cristo Fernández trong vai một bartender phục vụ Brock. Em trai của Holland, Harry được định đóng vai khách mời trong vai một tay buôn ma túy, sau khi làm điều tương tự trong Cherry, nhưng các cảnh của anh ấy đã bị cắt khỏi bản chiếu rạp.[23] Lexi Rabe, người đóng vai Morgan, con gái của Stark trong Avengers: Endgame (2019), cũng có một sự xuất hiện không có trong bản chiếu rạp.